Onderzoek

Multiplex DNA detectie Micro-organisme

Pagina-navigatie:

Overzicht

Wijzig Onderzoekgegevens

Titel	Multiplex DNA detectie Micro-organisme
Looptijd	03 / 2006 - onbekend
Status	Afgesloten
Onderzoeknummer	OND1315385

Samenvatting

Doel
Het beoogde doel van het project is het ontwikkelen van een universeel detectie- en identificatie platform dat toepasbaar is voor alle biologische monsters waaruit nog DNA geïsoleerd kan worden. Voorbeelden zijn: GGO detectie, pathogenen detectie, antibiotica resistentie onderzoek, species identificatie, en samenstellingsonderzoek. Het hiervan afgeleide doel is het ontwikkelen van een multi-detectie methode voor antibiotica resistentie genen in Salmonella.

Werkwijze
Voor het opzetten van een universeel detectie platform is gekozen voor de toepassing van Padlock probes (PLP) in combinatie met microarray detectie. Padlock-probes zijn lineaire enkelstrengs DNA moleculen die bestaan uit een aantal specifieke fragmenten. De belangrijkste fragmenten, gelegen aan weerszijde van het DNA molecuul, komen overeen met het te detecteren target DNA. Deze fragmenten bepalen de specificiteit van de test. Vervolgens bestaan de PLP's uit twee fragmenten waardoor het gedetecteerde target DNA vermenigvuldigd kan worden, waardoor de gevoeligheid van de test wordt vergroot. Tevens bevat een PLP een fragment dat noodzakelijk is voor het zichtbaar maken van de gemaakte kopieën van het aan te tonen DNA op de micro-array. Door het gebruik van PLP's is het mogelijk meerdere DNA targets tegelijkertijd te detecteren en te vermenigvuldigen. Het gebruik van de microarray maakt het mogelijk deze in één experiment zichtbaar te maken. Door het universele karakter is de microarray te gebruiken voor zowel de detectie van antibiotica resistentie genen in (pathogene) bacteriën danwel bijvoorbeeld voor de detectie van DNA targets die specifiek zijn voor genetisch gemodificeerde organismen.

Resultaten
Voor de detectie van antibiotica resistentie genen/elementen in Salmonella werd een assay ontwikkeld bestaande uit 42 PLPs. Deze PLPs zijn specifiek voor antibiotica resistentie genen/elementen die uit een eerder onderzoek frequent bleken voor te komen in Salmonella. De ontwikkelde test maakt het mogelijk om in een dag 48 Salmonella stammen te testen op deze 42 genen/elementen. In een specifiek experiment zijn vijftien S. Paratyphi B dT+ stammen waarvan vastgesteld was dat ze in het bezit waren van zowel een intl1 als intl2 element verder onderzocht op de aanwezigheid van antibiotica resistentie genen met het ontwikkelde multidetectie systeem. In 7 stammen werden additionele genen gevonden. Vele vormen van antibiotica resistentie zijn gebaseerd op puntmutaties in bestaande genen. Een bijzondere toepassing van PLPs is het kunnen aantonen van puntmutaties. Voor de detectie van puntmutaties betrokken bij antibiotica reistentie zijn vier PLPs ontwikkeld en getest. De gedane studies lieten zien dat deze PLP correct waren ontworpen en geschikt waren voor de beoogde toepassing.

Publicaties bij dit project zijn beschikbaar via deze Link

Samenvatting (EN)

Description:
The intensive use of antimicrobial agents in both animal husbandry and public health has resulted in the drastic increase in antibiotic-resistant bacteria. Drug resistance is becoming a worldwide problem, which is also demonstrated by the emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), multidrug resistance, and extended spectrum beta-lactamase (ESBL) producing bacteria. To combat the increase in antibiotica resistance, it will be necessary to gain knowledge on the mechanisms, diversity, and distribution that underly the observed antibiotic resistance (AR) characteristics. Molecular tools rather than phenotypic methods can provide this kind of information. As a result of the ongoing research on resistance, the number of described AR genes and AR-related mutations has increased enormously. Consequently, multidetection and screening methods will be necessary, rather than single-plex assays, to identify the gene(s) or mutation(s) responsible for the resistance phenotype.

Research objectives:
The development of a multiplex DNA test for the simultenous detection of multiple antibiotic resistance genes in Salmonella based on Padlock probes and microarray detection.

Results and products:
A DNA test was developed that enabled the detection of 42 antibiotic resistance genes and related elements that were frequently found among Salmonella. With this test it is possible to analyse 48 differrent strains in one day. The procedure encludes a multiplex ligation detection reaction (LDR) to generate ligated padlock probes that are amplified by PCR. The amplified fragments are subsequently hybridized to a low-density DNA microarray (ArrayTube system (ATs)) spotted with padlock-specific complementary Zip oligonucleotides and visualized. The specificity and selectivity of the padlock probes and customized ArrayTube microarray was tested with several control strains harboring nearly all of the AR genes and/or genetic elements represented on the microarray. In a specific experiments fifteen Dutch S. Paratyphi B dT+ strains that were demonstrated by PCR to harbor both intI1 and intI2, were further characterized with the novel microarray platform. In 8 strains no additional AR genes were identified with the ATs besides the resistant determinants already shown by PCR (Table 5). However in 7 dT+ isolates additional genes were found. Besides the 42 probes as mentioned above four probes were developed to detect mutations mediating a resistance phenotype. Initial experiments proved there correct design and ability to detect single nucleotide mutations.

Microarray Based Detection of Antibiotic Resistance Genes in Salmonella. Van Hoek en Aarts, Food Analytical Methods, 2008 (DOI 10.1007/s12161-007-9012-1)

Identification and characterization of multidrug resistant Salmonella Paratyphi B dT+ by PCR and ArrayTube microarray platform. Angela H. A. M. van Hoek, Sabrina Oostra-van Dijk, Thijs Weijers, Pieter Vos, H. J. M. Aarts and Dik Mevius (in prep)

Betrokken organisaties

Penvoerder	Plant Research International (WUR)
Samenwerking	RIKILT Wageningen UR (WUR)
Financier	Directie Agrokennis (EL&I)

Betrokken personen

Onderzoeker	Dr.ir. E.J. Kok
Projectleider	Dr. C.D. Schoen
Contactpersoon	Dr. H.J.M. Aarts

Bovenliggende onderzoeksactiviteit(en)

Programma	KB-06-005 Monitoring en detectie

Classificatie

A90000	Zuiver-wetenschappelijk onderzoek
D21300	Biochemie
D22100	Microbiologie
D23220	Inwendige geneeskunde