Onderzoek

STEC en pathogeniteitseilandjes

Pagina-navigatie:

Overzicht

Wijzig Onderzoekgegevens

Titel	STEC en pathogeniteitseilandjes
Looptijd	01 / 2006 - onbekend
Status	Afgesloten
Onderzoeknummer	OND1334861

Samenvatting

Doel
Sommige E. coli 's met combinaties van bepaalde virulentiefactoren zijn gedurende langere periodes op rundveebedrijven aanwezig. Dit KB6-project richt zich op de diagnostiek van virulentiefactoren terwijl een verwant KB8-project zoch focust op de modelmatige analyses van de dynamiek van virulentiefactoren. Het doel is kennis te ontwikkelen die bruikbaar is voor een early warning systeem.

Werkwijze
Kwantitatieve real time PCR in feces De kwantitatieve PCR is ontworpen voor zeven virulentie-factoren (vt1, vt2, eae, ehx, saa (Nielsen & Andersen JCM 2003), cif, en efa (deze studie)) en voor een referentie-gen, waarvoor een primer/probe set uit de literatuur is genomen die specifiek is voor het E. coli 16S rRNA gen (Huijsdens et al JCM 2002). Voor alle acht factoren wordt een ijklijn geproduceerd (zie ook hierboven) waarna de Ct's van de samples kunnen worden afgelezen in de ijklijnen en aan de hand van het 16S signaal berekend kan worden welke fractie van de E. coli populatie een bepaalde virulentie-factor heeft. In het laboratorium werkt dit als er DNA van twee stammen wordt gemengd; met hoeveelheden van 100 tot 0.001-0.0001 ng DNA is de verhouding terug te rekenen, waarbij het toegevoegde deel tot 30% kan afwijken van de daadwerkelijk toegevoegde hoeveelheid (vaak naar beneden). Deze PCR is getest met DNA geisoleerd uit rundermest afkomstig uit een Duitse longitudinale studie.

Ontwikkeling van gebruikersvriendelijke diagnostiek o.g.v. colloïdale nanodeeltjes Voor het ontwikkelen van gebruikersvriendelijke diagnostiek voor de detectie van de vijf 'klassieke' virulentie factoren (vt1, vt2, eae, ehx en saa) en 16S is gebruik gemaakt van dezelfde primer sequenties als in de real time PCR. Met gelabelde primers werden ampliconen gegenereerd met biotine en een specifieke tag. De ampliconen werden in een laterale flow immunoassay eerst gelabeld met nanodeeltjes van koolstof via de biotine, waarna ze werden ingevangen met geïmmobiliseerde antilichamen gericht tegen de tweede tag. Deze teststrip kunnen visueel worden beoordeeld door een gebruiker. In een alternatieve set-up werden de discriminerende antilichamen op een nitrocellulose array gespot waarna de koolstof-gelabelde ampliconen (met een specifieke tag) de gelegenheid kregen te binden aan de desbetreffende antilichamen. Dit type assay kan beoordeeld worden d.m.v. flatbed scanning en eenvoudige analyse daarvan.

Resultaten
De kwantitatieve real time PCR is getest met een subset van mestsamples. De gegevens komen maar zeer beperkt overeen met real time PCRs die elders zijn uitgevoerd met DNA geisoleerd na verrijkingl. De gevoeligheid van de PCR laat te wensen over; de mogelijke oorzaak is dat het in de mest aanwezige DNA tijdens opslag/transport is afgebroken t.g.v. herhaald vries/dooien van de te detecteren bacterien. De PCRs functioneren wel goed op DNA uit koloniemateriaal en zijn gebruikt voor de virulotyping van een set E. coli's uit een eerdere studie.

Publicaties bij dit project zijn beschikbaar via deze Link

Samenvatting (EN)

Description:
Cattle are a known reservoir of E. coli, of which certain types are (lethal) human pathogens, e.g. verotoxinogenic E. coli (VTEC) like O157:H7 that can cause hamburger disease . It has been observed that E. coli with certain genes are shed over longer periods of time, and become persistent. It is not known why particular types become persistent, and if particular combinations of virulence factors play a role in this.

Research objectives:
The goal of this project was to develop assays that can generate data suitable for studying the dynamics of virulence factors.

Results and products:
For this project the a quantitative real time PCR for several virulence factors was developed. When DNA of two different strains are mixed, this PCR is able to generate data with which the fraction added can be estimated. However, attempts to perform such a relative quantification in feces samples has not been successful. A validated protocol for sample storage and a more sensitive PCR are crucial before this ambition can be fulfilled.
Furthermore, two assays based on visual detection of carbon nanoparticles were developed. These assays use similar amplicons, but detection is performed using antibodies directed against a tag on one primer, whereas the amplicons are labeled with carbon through biotin on the other primer. Amplicons are bound in a lateral flow assay or on an 'array', to the antibodies that are immobilized on a nitrocellulose matrix.

manuscript: D Döpfer, C Sekse, L Beutin, H Solheim, FJ van der Wal, A de Boer, JS Slettemeås, Y Wasteson, AM Urdahl, Pathogenic potential and horizontal gene transfer in ovine gastrointestinal Escherichia coli strains the usefulness of an extended characterization in outbreak source investigation, submitted to Journal of Applied Microbiology.
poster: M van Tuil, FJ van der Wal, A de Boer, A Moers, A van Amerongen, Rapid methods to detect virulence factors of verotoxinogenic Escherichia coli in cattle, Rapid Methods Europe 2009, 26-28 januari 2009, Noordwijk, THe Netherlands.

Betrokken organisaties

Penvoerder	Centraal Veterinair Instituut (WUR)
Financier	Directie Agrokennis (EL&I)
Samenwerking	Food & Biobased Research (WUR)

Betrokken personen

Onderzoeker	Dr. A. van Amerongen
Projectleider	Dr. F.J. van der Wal

Bovenliggende onderzoeksactiviteit(en)

Programma	KB-06-002 Early warning systemen

Classificatie

A22000	Veeteelt
D21500	Histologie, celbiologie
D22100	Microbiologie