| Title | The analysis of intact nitrofuran protein adducts |
|---|---|
| Period | 01 / 2007 - 12 / 2009 |
| Status | Completed |
| Research number | OND1337239 |
| Description: Nitrofurans are antibiotics that have been banned in the European Union for use as veterinary drugs, due to their toxic an suspected carcinogenic properties. It is important that chemical methods are available to check on the use of these illegal drugs. Upon administration nitrofurans are very rapidly metabolised. In this process reactive metabolites are formed which can react with proteins, RNA and DNA. Nitrofuran protein adducts are quite stable, staying in the body up to several weeks or months after use. Due to the complexity of the formed adducts it was not possible in the past to analyse these nitrofuran protein adducts directly. If the identity of the adducts is established they can be used as biomarkers. Analysis of these markers in animal tissues (blood, muscle, liver) can prove unequivocally the illegal use of nitrofurans, even if these drugs have been administered in the past. Research objectives: The aim of this project is to determine if with the use of modern mass spectrometric techniques it is possible to analyse thes protein adducts in sufficient detail and to develop methods for their detection in animal tissues. Acitivities: - Development of a microsomal incubation system for the preparation of nitrofuran protein adducts. Furazolidon is used as representative of the nitrofurans and albumin (BSA) as model protein. - Isolation of the albumin protein fraction with gel electrophoresis and preparation of protein digests (tryptic digests). - Analysis of the tryptic digests with nano-LC-Orbitrap-MS (Department of Biochemistry, Dr. Jacques Vervoort). - Identification of the most important nitrofuran protein adducts. - Application of the method on incurred samples from previous animal studies. Determination of applicability (proof of principle), detection limits. - Extention to other nitrofurans and other target proteins (for example muscle and liver proteins). Results and products: - The microsomal test system has been developed and adducts of furazolidon with albumin have been produced. - The isolation of the albumin fraction has been carried out, as well as the preparation of tryptic digests. - Analysis of the protein digests has resulted in the identification of some promishing furazolidon albumin adducts, that will be investigated in more detail. - In 2009 the results will be verified by means of incurred samples obtained in previous animal studies. Based on the outcome of these experiments recommendations will be made for further research and/or application to official control. - Within the project it will not be possible to look into adduct formation of nitrofurans with other relevant proteins. |
| Doel Nitrofuranen zijn antibiotica die vanwege hun toxische en mogelijk kankerverwekkende eigenschappen door de Europese Unie verboden zijn als diergeneesmiddel. Het is belangrijk dat er chemische methoden beschikbaar zijn om op de aanwezigheid van deze verboden middelen te kunnen controleren. Nitrofuranen worden na toediening zeer snel in het lichaam gemetaboliseerd. Hierbij ontstaan reactieve metabolieten die onder andere kunnen reageren met eiwitten, RNA en DNA. Nitrofuraan-eiwitten zijn relatief stabiel en blijven daardoor nog weken of zelfs maanden in het lichaam aanwezig. Vanwege de complexe structuur van de gevormde adducten was het voorheen niet mogeljk de intacte eiwit-nitrofuraan adducten te meten. Indien het mogelijk wordt deze adducten te identificeren kunnen zij als biomarkers gebruikt worden. Door deze markers in dierlijke matrices (bloed, vlees, lever) te meten, kan misbruik eenduidig worden vastgesteld, ook indien dit al een tijd geleden heeft plaatsgevonden. In dit project wordt onderzocht of het met behulp van moderne massa spectrometrische technieken mogelijk is deze eiwitadducten in voldoende detail te analyseren om er vervolgens methoden voor hun detectie in dierlijke matrices mee te ontwikkelen. Werkwijze - Ontwikkeling microsomaal incubatiesysteem voor de bereiding van nitrofuraan-eiwitadducten. Hierbij wordt in eerste instantie furazolidon gebruikt als representant voor de nitrofuranen en albumine (BSA) als model eiwit. - Isolatie van de albumine eiwitfractie met gelelectroforese en bereiding van eiwit hydrolysaten (tryptic digests). - Analyse van de eiwit hydrolysaten met behulp van nano-LC-Orbitrap-MS (Vakgroep Biochemie, Dr. Jacques Vervoort). - Identificatie van de belangrijkste nitrofuraan-eiwitadducten. - Toepassing van de methode op monsters afkomstig uit vroegere dierstudies. Vaststellen toepasbaarheid (proof of principle), detectielimieten. - Uitbreiding naar andere nitrofuranen en naar andere doeleiwitten (bijvoorbeeld spiereiwitten, lever). Resultaten - Het microsomale testsysteem is opgezet en bruikbaar voor de bereiding van eiwitadducten met furazolidon. - De isolatie van de eiwit fractie is uitgevoerd evenals de bereiding van de eiwit hydrolysaten. - Analyse van de eiwit hydrolysaten heeft een aantal furazolidon eiwitadducten opgeleverd die veelbelovend zijn en verder onderzocht zullen worden. - In 2009 zullen de resultaten worden geverifïeërd aan de hand van monsters afkomstig uit dierstudies. Aan de hand van deze resultaten zal een aanbeveling worden gedaan voor verder onderzoek en/of toepassing in de praktijk. - Binnen het project is helaas geen ruimte meer om naar andere relevante eiwitten te kijken. Publicaties bij dit project zijn beschikbaar via deze Link |
| Secretariat | RIKILT Wageningen UR (WUR) |
|---|---|
| Financier | Department of Knowledge (EL&I) |
| Researcher | Dr.ir. L.A.P. Hoogenboom |
|---|---|
| Researcher | H. Hooijerink |
| Project leader | Dr. P.P.J. Mulder |
| A71000 | Nutrition |
|---|---|
| D21000 | Life sciences |
Go to page top
Go back to contents
Go back to site navigation