KNAW

Onderzoek

Nano-technologie 2008

Pagina-navigatie:


Wijzig gegevens


Titel Nano-technologie 2008
Looptijd 01 / 2008 - 01 / 2010
Status Afgesloten
Onderzoeknummer OND1337244

Samenvatting

Doel
Implementatie van in vitro translocatie model als tiered approach dat waarschijnlijk gebruik kan worden bij de hazard assessment van nanodeeltjes (ENP's) in voeding. Gebruik maken van de interdisciplinaire kennis binnen RIKILT en Wageningen UR: nanotoxicologie, in vitro testen (kinetiek en effecten) en analytische detectie/karakterisatie van ENP's.

Werkwijze
Er is weinig kennis beschikbaar over de veiligheid van de toepassing van nanotechnologieën en het verwerken van nanodeeltjes in voeding en in landbouwkundige hulpstoffen. Vooral inzicht in de biobeschikbaarheid, distributie en metabolisme in het organisme (toxicokinetiek) en de uiteindelijke toxiciteit in de organen waar nanodeeltjes uit voeding accumuleren (toxicodynamiek) ontbreekt. Deze kennis is essentieel voor de risicomanager om een goede veiligheidsbeoordeling te maken van voedingsproducten en landbouwkundige hulpstoffen waarin nanodeeltjes zijn verwerkt of kunnen vrijkomen.
Aan een deelaspect van deze brede vraagstelling zal in dit project gewerkt worden. Begin 2008 worden bovenstaande projecten in de RIKILT nanowerkgroep besproken en zal de exacte probleemstelling voor het onderhavige kennisbasisproject vastgesteld worden (dit ook in overleg met de KB-trekker van thema 6).

Resultaten
Het project had in 2008 twee fasen: 1) Implementatie van een in literatuur beschreven in vitro model. 2) Testen van model nanodeeltjes (NP's) op dit model. Daarnaast is een deel van het budget als cofinanciering gebruikt voor het FP7 project NanoImpactNet.
Fase 1: Het in vitro transwell translocatie model (co-cultuur van caco-2 cellen en Raij-B cellen; Des Rieux et al.,2007) is succesvol op het RIKILT geïmplementeerd. De Raij-B cellen zetten (een deel van de) caco-2 cellen aan tot differentiatie in M-cellen. De M-cellen zijn in vivo gespecialiseerd in de translocatie van deeltjes. Daarmee is het modelsysteem een goed in vitro model voor de humane darmwand.
Er zijn door ons verschillende studies uitgevoerd om de betrouwbaarheid en robuustheid van het model aan te tonen. De hiervoor benodigde testen zijn moesten eerst geoptimaliseerd worden. a) Door middel van histologische technieken is aangetoond dat er daadwerkelijk M-cellen in de co-cultuur aanwezig zijn (hiervoor is een antilichaam tegen galactine -9 is als specifieke marker voor M-cellen gebruikt). b) Bij het uitvoeren van translocatiestudies met dit model is het belangrijk dat de integriteit van de cellaag goed is. Naast de traditionele maat hiervoor (TEER metingen), hebben we de integriteit bepaald door blootstelling aan bepaalde in literatuur beschreven peptiden (Dextranen, Lucifer Yellow in verschillende groottes). Enerzijds is gebleken dat we een goede monolaag kunnen laten groeien, anderzijds hebben we de TEER-meting gecalibreerd met de translocatie-studies van peptiden. Dit vereenvoudigd toekomstige experimenten.
Om de eventuele translocatie van NP's over het model te interpreteren is het nodig om te weten of er schade aan de cellen ontstaat ten gevolge van de blootstelling aan NP's. Daartoe zijn enkele standaard cytotoxiciteit testen aangepast voor gebruik in een transwell systeem. Op dit moment hebben we de volgende testen geïmplementeerd: LDH, MTT en oxidatieve stress.
Conclusie van deze fase is dat we een model systeem geïmplementeerd hebben waarmee we translocatiestudies van NP's kunnen uitvoeren, in combinatie met onderzoek naar locale toxicologische effecten. Dit model kan in potentie ingezet worden voor het uitvoeren van screening van NP's zoals gebruikt in voeding in een tiered-approach van de gevaar identificatie van NP's.
Fase 2: Het testen van NPs op het modelsysteem bleek problematisch, in die zin dat de beschikbaarhied van NPs gering is. Er zijn geen referentie nanomaterialen beschikbaar. Dit is een groot probleem voor het uitvoeren van studies met NPs (voor elk type studies) en heeft in de wetenschappelijke wereld veel aandacht. De crux van het probleem voor dit project zit bij het in suspensie brengen van NPs zodat het cellen in het model hieraan blootgesteld kunnen worden. Daartoe hebben we commercieel beschikbare NPs in huis gehaald waarmee in verschillende blootstellingsconcentraties experimeteten uitgevoerd kunnen worden. Pogingen om betrouwbare suspensies te maken zijn grotendeels mislukt. Dit werk (en de karakterisatie van de NPs) zijn in nauwe samenwerking met een meetproject dat door de VWA (ondersteuningsfunctie VWA-BuR) bij RIKILT is uitgezet.
Inmiddels is een (internationaal) netwerk van NPs producenten opgebouwd, waarbij potentieel geschikte NPs zijn geïdentificeerd. Het in huis halen van deze NPs is in 2008 gestart. Daarnaast zijn op het RIKILT op eenvoudige wijze zelf zilver NPs gemaakt (als pragmatische oplossing). Met deze deeltjes zijn de eerste pilot experimenten uitgevoerd.
Cofinanciering WP1 NanoImpactNet: NanoImpactNet is een Europees Netwerk voor health and environmental impact of nanomaterials . RIKILT was trekker van een workshop in juni over: Minimal analytical characterisation of engineered nanomaterials need for hazard assessment in biological matrices. Deze workshop is goed bezocht en heeft als een consensus rapport (deliverable 1.2) voor dit EU project opgeleverd. Streven is dit rapport in 2009 om te zetten in een publicatie.

Publicaties bij dit project zijn beschikbaar via deze Link

Samenvatting (EN)

Description:
In this project RIKILT implemented a model system that previously was described in literature (Des Rieux et al., 2007). In this model cells are cultured in a transwell system, resulting in a co-culture of enterocytes and M-cells as and improved model system for the human gastero-intestinal tract. This models allows to study the in vitro translocation and potential local toxicological effects upon exposure to NPs. If validated this model can be used as a screenings tool in a tiered hazard assessment approach.

Research objectives:

- Implement the co-culture of caco-2 cells and Raij-B cells as an improved model for the human gastrointestinal epithelium. The Raij-B cells trigger the caco-2 cells to differentiate into M-cells. The M-cells are specialized in the uptake of particles.
- Prevalidate the co-culture model.
- Test the suitability of the model by exposing it to selected model engineered nanoparticles.

Results and products:
The project in 2008 had two phases:
Phase 1: Implementing and prevalidating the co-culture model by:
1. histological evaluation. We confirmed that M-cells are indeed present in the model. This has been shown by using a antibody against galactine-9, which is a specific marker for M-cells.
2. Determining the integrity of the monolayer. To perform translocation studies the monolayer of cells need to be intact. This can be assessed by using trans epithelial resistance as a measure. This was complemented by studying the translocation of often used peptides (Dextrans and Lucifer Yellow).

The results indicated that the monolayer is intact, enabling us to perform translocation studies.
Phase 2: Assessing the translocation of model NPs.
To do this we needed to have stable suspensions of well characterized NPs. It was problematic to obtain these reference materials. While we starting building an international network with experts that are using these NPs only we only ably to initiate experiments in the last months of the project. We did use 'in house' produced NPs for these studies. This resulted in some experience, but studies clearly need to be replicated before any firm conclusions can be drawn
In addition part of the project budget was allocated for the participation in the FP7 project NanoimpactNet. in 2008 we organized a workshop on Minimal analytical characterisation of engineered nanomaterials need for hazard assessment in biological matrices. This was a succesful workshop the proceedings will be submitted to a peer reviewed journal in 2009.

Betrokken organisaties

Betrokken personen

Bovenliggende onderzoeksactiviteit(en)

Classificatie

A71000 Voeding
C60000 Nanotechnologie
D16800 Simulatie, virtual reality

Omhoog
Ga terug naar de inhoud
Ga terug naar de site navigatie