KNAW

Onderzoek

PCR, isotherme amplificatie

Pagina-navigatie:


Wijzig gegevens


Titel PCR, isotherme amplificatie
Looptijd 07 / 2007 - onbekend
Status Afgesloten
Onderzoeknummer OND1337296

Samenvatting

Doel
Dit project heeft als doel te onderzoeken of isotherme amplificatietechnieken mogelijkheden bieden voor de veterinaire (on site) diagnostiek. Er zal een prototype ontwikkeld worden voor eìeìn virale dierziekte. De testspecificaties, zoals diagnostische sensitiviteit en specificiteit zullen onderzocht worden. De mogelijkheden voor een dergelijke snelle test zal in kaart worden gebracht, oftewel is de methode fit for purpose . De validatie zal aangeven hoe betrouwbaar en robuust een dergelijke snelle diagnostische test is. Tenslotte zal de ontwikkelde test een voorbeeld zijn voor testontwikkeling voor andere virale pathogenen.

Werkwijze
In de eerste fase van het onderzoek is geprobeerd aan te tonen dat de principes waar het project op is gebaseerd werken. Eerst is het principe van de isotherme amplificatie door middel van een gecombineerde werking van een nicking endonuclease en een DNA polymerase getest op de target locatie waarop de geaccrediteerde schapen-en-geitenpokken real-time PCR ook is gebaseerd. Hiervoor werd gebruik gemaakt van een zogenaamd artificieel template. In dezelfde fase werd ook het detectiesysteem met behulp van een zogenaamd 'molecular beacon' uitgetest. Vervolgens werd het three-way-junction (3WJ) principe het vormen van een T-vormige DNA-structuur met behulp van twee lange oligonucleotiden- uitgeprobeerd. In deze fase werd aangetoond dat met behulp van een artificieel template een target onafhankelijk amplicon werd gevormd dat met behulp van een molecular beacon kon worden aangetoond.
Het vertalen van het proefsysteem met artificieel template naar een test op veldmateriaal bleek echter niet eenvoudig. Het systeem was niet gevoelig genoeg. Pogingen het systeem gevoeliger te maken door het toevoegen van een extra target-oligo waardoor de reactie een exponentieel verloop krijgt, zorgde voor aspecifieke reacties. Besloten werd om naast het optimaliseren van het oorspronkelijke testprincipe ook te kijken naar andere isotherme amplificatie-methoden. Uit deze pilot kwam de zogenaamde helicase-dependent-amplificatie (HDA) als meest veelbelovend naar voren. Vanwege de voortdurende problemen met het 3WJ-systeem is besloten de rest van de projecttijd te besteden aan het opzetten van een test met dit principe.

Resultaten
In het laatste jaar van het project zal de aandacht zich vooral richten op de HDA-methode. De nog aan te stellen nieuwe projectmedewerker zal de mogelijkheden van deze techniek gaan onderzoeken. In de laatste fase van het project zal ook nauw worden samengewerkt met het binnen de groep aviaire virogie draaiende project dat zich ook richt op het ontwikkelen van een isotherme amplificatietechniek voor de diagnostiek van aviaire influenza.

Publicaties bij dit project zijn beschikbaar via deze Link

Samenvatting (EN)

Description:
The aim of this project is to investigate the possibility of using isothermal amplification techniques in veterinary (on-site) diagnostics. We will try to develop a prototype test for one viral animal disease. Test specifications like sensitivity and specificity will be investigated. Fitness for purpose will be judged and if found in order the test will form a example for the development of similar test for other viral diseases.

Research objectives:
In the first phase we have tried to proof the principles of the test system. The combined action of a nicking endonuclease and a DNA-polymerase was tested with an artificial template based on the ISO-accredited sheep-and-goatpox real-time PCR test developed in our lab. In the same phase the detection system using a molecular beacon was tried out and evaluated. In the next phase the three-way-junction (3WJ) the formation of a T-DNA using two long oligonucleotides- was tested. In this phase we could demonstrate target independent amplification of a small DNA amplicon that could be detected using a molecular beacon.
Converting the system to a field situation however proved to be very difficult. The system was much too insensitive, and upon trying to improve sensitivity by introducing an exponential amplification step we also introduced aspecific reactions.
We decided to try to optimalize the system, and in the meantime to broaden our horizon by looking for other potential isothermal amplification reactions. In this pilot study the so called helicase-dependent-amplification (HDA) looked very promising. Because of the continuing problems with the 3WJ we decided to focus our attention on the HDA system in the final phase of the project.

Results and products:
In the final phase of the project we will try to develop a diagnostic test for sheep-and-goatpox virus (DNA virus) based on the HDA method. If succesfull other viral diseases, preferrably an RNA virus such as Avian Influenza, will be tested with the method.

Betrokken organisaties

Betrokken personen

Onderzoeker Dr. E.A. Kooi
Projectleider Dr. P.A. van Rijn

Bovenliggende onderzoeksactiviteit(en)

Classificatie

A22000 Veeteelt
D21300 Biochemie
D21800 Immunologie, serologie
D22100 Microbiologie

Omhoog
Ga terug naar de inhoud
Ga terug naar de site navigatie